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土霉素試劑盒檢測(組織、牛奶、飼料、蜂蜜)
更新時間:2022-09-14 點擊量:1155

土霉素酶聯免疫試劑盒說明書

一、藥物概述及檢測原理

 歐盟第675/92號令中初步規定在肌肉及牛奶中的四環素族化合物的總量不得超過100ppb,在腎臟,肝臟及雞蛋中分別不得超過600 ppb300 ppb200ppb

本公司的土霉素酶聯免疫試劑盒使用全新一代生物技術開發,具有方便、快速、靈敏等特點。

本試劑盒利用土霉素抗體與土霉素可產生特異性結合的性質,先在酶標板上預包被抗原,再加入標準品(樣本)和土霉素抗體,樣本土霉素藥物與固定在酶標板上的抗原競爭土霉素抗體,最后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標準品(樣本)中土霉素藥物的含量成反比。

 

二、試劑盒內包含組分:

10×標準品濃縮液:0 ppb4ppb12 ppb36 ppb108 ppb0.5mL/瓶。

96孔酶標板:1

土霉素抗體工作液:1瓶(7mL/瓶)

酶標二抗工作液:1瓶(7mL/瓶)

20×濃縮洗滌液:1瓶(30 mL/瓶)

20×濃縮復溶液:1瓶(10 mL/瓶)

底物A液:1瓶(7 mL/瓶)

底物B液:1瓶(7 mL/瓶)

終止液:1瓶(7mL

說明書

蓋板膜

三、用戶需要自備的設備和試劑

儀器:

酶標儀(檢測波長450 nm630 nm

電子天平(精度:0.01 g

離心機(4000 g及以上)

生化培養箱(可調25℃、37℃、60℃)

旋渦振蕩器

微量移液器:(20μl-200μl100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍)

計時器

試劑:(試劑均為分析純

去離子水

 

四、試劑盒特異性

   試劑盒與其他藥物的交叉反應率:

土霉素…………………………100%

金霉素…………………………240%

四環素…………………………200%

強力霉素(多西環素)……………………20%

 

五、樣本檢測步驟

1. 工作液準備

復溶工作液:取120×濃縮復溶液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

洗滌工作液:120×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

1 M鹽酸溶液:量取1ml濃鹽酸加去離子水11ml溶解混勻即得。

2. 樣品前處理

組織樣本(稀釋倍數:12

準確稱取1±0.01 g均質后的組織樣品于10 mL離心管中;

加入5 mL去離子水,劇烈渦動2min

4000 g以上,離心10 min

500ul上清液加入500ul復溶工作液(見5.1)中,渦動10min

50ul進行檢測。

蜂蜜樣本(稀釋倍數:10

精確稱取1±0.01g蜂蜜樣品于10mL離心管中;

加入2mL去離子水,充分渦動1 min溶解分散;

100ul溶解液加入400ul復溶工作液中,渦動1 0S混勻;

立即取50ul進行檢測。

液態奶樣本方法一(稀釋倍數:10)(同卡那霉素液態奶方法一致)

采樣好的液態奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上;

將槍頭伸入原奶樣本下層,小心取出1ml樣本加入2ml離心管中(注意:盡量不要取到上層的奶油);

加入50μL 1M鹽酸(見5.1),強烈震搖1min (或使用渦動儀渦動30s);

使用離心機室溫4000 g以上離心10 min

取上層清亮液體50μL加入另一干凈離心管中(注意:盡量不要取到最上層的奶油),再加入450μL復溶工作液,強烈震搖1min (或使用渦動儀渦動30s);

50 μL液體進行分析。

液態奶樣本方法二(稀釋倍數:40)(同卡那霉素液態奶方法一致)

精確量取50ul液態奶樣品于1950ul復溶工作液中;

充分渦動1 min混勻;

立即取50ul進行檢測。

飼料(牛飼料、豬飼料)(稀釋系數:200

準確稱取 1±0.01 g 飼料樣品于 50mL 離心管中;

加入 5 mL 去離子水,充分渦動 2min 至飼料*分散;

4000 g 以上,離心 10 min

40 μL上清液于新的離心管中,加入1560μL 復溶工作液 ,充分渦動 30 s

立即取 50μL 進行檢測。

3. 檢測

準備:將要使用的酶標板條插入酶標板架上,并記錄各標準品和樣品的位置,為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗(每個樣本/標準品點兩孔),未使用的酶標板條用自封袋密封后,保存于2-8℃環境中以防變質;

標準品工作液配制:分別取52ml離心管,標記為00.41.23.610.8ppb;于每個管中加入900ul復溶工作液,于對應管中加入100ul10×標準品濃縮液000.4—41.2—123.6—3610.8—108);

加樣:向對應微孔中加入標準品工作液/樣品溶液50 μL,再向每孔中加入50 μL酶標二抗工作液,再向每孔中加入50 μL抗體工作液;

孵育:輕輕振蕩酶標板10 s,使孔內液體充分混勻后,蓋好蓋板膜于25℃避光反應30 min

洗滌:取出酶標板后小心揭開蓋板膜,倒出板孔中液體后,在每孔加 250 μL洗滌工作液,浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液,然后再加入洗滌工作液重復洗滌3~4次后,將酶標板倒置于吸水紙上,用力拍干;

顯色:在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液(注:底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合,混合液在10 min內使用,切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質失效);

孵育:輕輕振蕩酶標板10 s,使孔內液體充分混勻后,蓋好蓋板膜于25℃避光反應15 min

終止:在反應后的微孔中加入終止液50μL/孔,底物液由藍變黃表明終止成功。

讀數:終止后的酶標板應在5 min內用酶標儀讀數,建議使用450 nm630 nm雙波長讀取酶標板吸光度值。

4. 計算結果

設各標準品(或樣品)的吸光度平均值為B,零標準(濃度為0 ppb的標準品)吸光度平均值B0(B/B0)×100%為各標準品(或樣品)對應的吸光度的百分比:

使用半對數系統代入標準品對應的吸光度的百分比,與標準品濃度擬合出標準曲線。

將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中,即可得出樣品對應的濃度,最后乘以樣品相應的稀釋倍數,即可得出樣品中檢測物含量。

 

六、試劑盒參數

試劑盒靈敏度:0.4 ppb

標準曲線范圍:0.4 ppb-10.8ppb

板內變異系數:<5%

板間變異系數:<15%

B0吸光度最佳值:>0.8

回收率:90%±15%

樣品最低檢測限:

  組織……………………………約12ppb

   蜂蜜……………………………約20ppb

   液態奶樣本方法一……………約20ppb

   液態奶樣本方法二……………約40ppb

   飼料……………………………約600ppb

注:ppb=ng/mLng/g

 

七、分析限制

   本試劑盒為定量或半定量試劑盒,建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結果為陽性,建議使用儀器方法開展確證實驗(如GC/MSLC-MS/MS等)。

 

八、試劑盒貯存條件

試劑盒最佳貯存溫度為2-8℃,切勿凍存。

未使用完的酶標板須密封保存2-8℃的環境中。

 

九、注意事項

使用試劑盒前,請務必仔細閱讀說明書。

試劑盒使用前,需將盒內各組份置于實驗臺上回溫至室溫(25±2℃)(提示:約1 h)。

試劑使用前需搖勻,混合時應避免出現氣泡。

槍頭為一次性用品,為防止試劑交叉污染,檢測過程中所用槍頭不得重復使用。

請勿使用過期試劑盒,不同批號試劑盒中的試劑不得混用。

樣品處理完畢后請立即分析,否則可能影響檢測結果。

底物A液、底物B液均為無色透明液體,若在使用前已變成藍色,或混合后立即變藍,說明試劑已污染或變質。

加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速,以免反應時間差對檢測結果產生影響。

終止液中含有硫酸,若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水沖洗。若不慎入眼,請在*清洗后去醫院檢查。

 

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